猪副流感病毒5型全基因组序列分析及反向遗传操

2020-07-20 体育在线新闻 阅读

  【摘要】:猪副流感病毒(porcine parainfluenza-5 virus,PPIV5)系不分节段的单股负链RNA病毒,为副粘病毒科,腮腺炎病毒属成员之一。在1956年该病毒首次在猴体内被发现和被分离,并被命名为猴病毒5型(SV5),在1995年国际病毒学分类委员会上该病毒被正式命名为(simian parainfluenzavirus 5)。后该病毒在其他动物体内及细胞培养物中均被检测到,意味着猴并不是该病毒的唯一宿主,于是在2009年病毒学分类委员会上该病毒被首次命名为(parainfluenza virus 5,PIV5)。2018年国际病毒学委员会上将该病毒重新命名为(mammalian rubulavirus 5),本文中将使用PIV5表示副流感病毒。在本实验室前期工作当中,将该病毒做仔猪动物回归实验(详细数据另行发表,未在本文中体现),结果表明该病毒虽然可感染猪肠道但不会导致腹泻及体温升高,尽本人所知无文献报道该病毒会导致猪只严重疾病。故本研究目的为建立PPIV5的反向遗传操作系统,为作为递送外源蛋白的载体奠定基础。将分离到的PPIV5病毒命名为CHNJS-17株,根据Gen Bank上所公布的序列,我们设计了6对引物,覆盖了除3’和5’端的病毒的基因组,通过RT-PCR方法扩增其相应序列,并对这6个序列进行T载体连接及转化至感受态细胞,提取质粒后测序。同时,利用RACE技术测定了PPIV5的3’和5’端具体序列。我们测得的序列分析结果显示,本实验室分离到的毒株全长15 246 bp,符合副粘病毒的“六碱基原则”。纤突蛋白F及HN与经典毒株W3A株比较氨基酸差异较小,分别为98.3%和97.3%,小疏水蛋白(SH)差异最大,为91.1%。将CHNJS-17株与NCBI所公布的28株PIV5全基因组序列进行比对,进化树分析显示与登录号为KX100034株、KY685075株、MH370862株、MG921602株、MH362816株同在一个进化分支,同源性分析显示与MG921602株、MH362816株、MH370862株、KX100034株、KC237064株最高,为99.8%,与KY114804株同源性最低,为97%。由此可知PIV5的进化树划分及同源性与宿主种属之间无相关性。表达T7聚合酶的重组痘病毒(MAV-T7)可提供T7聚合酶并被应用于拯救负链RNA病毒(negative-strand RNA viruses,NSV),为了成功拯救PPIV5,本实验选用其作为转录病毒基因组之用。本研究使用的载体为p OK12载体,该载体为低拷贝载体,可容纳较大基因组。在全基因组的3’端加入T7启动子和稳定T7启动子的三个脱氧核苷酸G,及锤头状核酶(hammerhead ribozyme,Ham Rz),在5’端加入丁戊肝核酶(hepatitis deltavirus ribozyme,Hdv Rz)和T7终止子。PIV5符合副粘病毒中的“六碱基原则”,故加入的Ham Rz和Hdv Rz可保证病毒基因组的精确切割,提高病毒拯救成功率。由于本病毒为负链RNA病毒,故在病毒转录中必不可少的辅助蛋白为核衣壳蛋白NP、磷酸化蛋白P、大聚合酶蛋白L,在本研究中以pc DNA3.1(-)为载体分别构建表达NP、P、L的三个辅助质粒,与病毒基因组全长质粒按4:2:2:1的比例共转染提前感染了MAV-T7的仓鼠肾细胞(BHK21),方可拯救病毒。为区别拯救毒株与野生毒株,在病毒基因组中加入了亲本毒株中不存在的分子标签,通过鉴定能够区分野毒株的与拯救毒的分子标签4768G-(T),鉴定结果为突变成功,将拯救的PPIV5命名为r PIV5-4768G(T),通过电镜观察拯救的r PIV5-4768G(T)符合副粘病毒的外形特征,大小不一,具有多形性,视野内可观察到由病毒破裂而流出的“拉锁型”病毒基因,病毒外膜布满密集的纤突,间接免疫荧光(IFA)结果显示病毒拯救成功,一步生长曲线显示拯救毒与亲本毒在第12小时存在差异。以无致病性的PPIV5为亲本毒的r PIV5-4768G(T)反向遗传系统的建立可以作为很好的载体,为外源病毒蛋白的表达尤其是猪源肠道病毒如猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的表达奠定基础。

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